激光共聚焦顯微鏡細胞培養(yǎng)樣品的制備方法
激光共聚焦顯微鏡細胞培養(yǎng)樣品的制備方法主要包括以下幾個步驟：
玻璃片的處理：
選擇的蓋玻片應小于0.17mm厚，且質量好、光潔、無雜質。
購買的蓋玻片需要用玻璃洗液浸泡處理一天以上，再用去離子水沖洗掉殘存的洗液。
對于重要的實驗，還需要檢查載玻片、蓋玻片的光學特性，確保無熒光干擾。
玻璃片經過高溫滅菌處理后，放置在細胞培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)細胞。
如果細胞貼壁不牢（如293T細胞），或者與細胞外基質相關的研究，玻璃片需預先包被細胞外基質，如poly-L-Lysine, Fibronectin, Laminin等。
細胞培養(yǎng)和轉染：
哺乳動物細胞按照標準的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。
在進行轉染細胞前一天，按1:4的比例，將培養(yǎng)的細胞鋪在含有玻璃片的細胞培養(yǎng)皿中。
轉染細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，使得GFP標記的蛋白的表達水平達到能被熒光顯微鏡檢測的水平或實驗所需要的時刻。
樣品固定：
樣品固定是為了保持樣品的形態(tài)和結構，常用的固定方法包括甲醛、乙醇、冰醋酸、戊醛等。
對于組織樣本，常用的固定方法是將其浸泡在緩沖福爾馬林中，然后進行脫水和浸漬。
滲透處理：
如果樣品在固定后出現(xiàn)浸泡不透的情況，需要進行滲透處理，使固定液更好地滲透進入樣品中。
常用的滲透處理方法包括冷凍冰醋酸滲透、冷凍減壓滲透、甘油滲透等。
樣品處理和染色：
經過固定的樣品可能需要進行處理和染色，以去除不需要的物質（如脂肪和膽固醇）并增強對細胞或組織的觀察。
處理步驟可能包括使用洗滌劑（如Tween 20或Triton X-100）去除雜質，以及使用DNA染料（如熒光素和硫醇葡萄糖）進行染色。
脫水和包埋：
脫水是為了將樣品中的水分逐漸去除，使其適應顯微鏡對環(huán)境的要求。這通常通過逐漸加入濃度遞增的乙醇溶液來實現(xiàn)。
包埋是將樣品固定在透明塊中，以便于顯微觀察。常用的包埋介質包括瓊脂和覆蓋玻璃等。
樣品標記：
樣品需經熒光探劑標記，可進行單標、雙標、三標等標記方法，以便于在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。
以上是激光共聚焦顯微鏡細胞培養(yǎng)樣品制備的主要步驟和注意事項，確保樣品制備的準確性和實驗的順利進行。
