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相差和顯微鏡
有助呈現(xiàn)生物樣本的未染色透明結(jié)構(gòu)
相差是一種光學(xué)顯微鏡技術(shù)，用于增加未染色樣本的對比度。未染色樣本的結(jié)構(gòu)，例如活細(xì)胞或其細(xì)胞器，在明場照明下觀察時(shí)可能顯得模糊，甚至變得透明。若使用相差顯微鏡觀察相同的樣本和結(jié)構(gòu)，就能以更高的對比度和更豐富的細(xì)節(jié)，清楚呈現(xiàn)這些樣本和結(jié)構(gòu)。
利用相移進(jìn)行成像
由于人眼或光電傳感器僅能觀察到光波振幅（即強(qiáng)度）或波長（即顏色）的變化，因此對樣本進(jìn)行染色可以誘導(dǎo)振幅變化，導(dǎo)致光線穿過樣本后在強(qiáng)度和/或顏色上出現(xiàn)差異[1]。會引起光波振幅變化的樣本或其結(jié)構(gòu)稱為振幅物體[1]。染色劑非常有用，因?yàn)樗鼈兛梢葬槍颖局械奶囟ńY(jié)構(gòu)染色，不過它們可能導(dǎo)致活細(xì)胞中毒。
相差顯微鏡能夠利用光路長度差異引起相移，從而視覺呈現(xiàn)原本難以觀察到的模糊樣本結(jié)構(gòu)[1]。它借助新形成光波的干涉將相移轉(zhuǎn)化為振幅偏移。在光線穿過時(shí)會引起相移的樣本或其結(jié)構(gòu)稱為相位物體[1]。
相差顯微鏡技術(shù)誕生于1930年代，由荷蘭物理學(xué)家弗里茨·澤尼克發(fā)明[1-3]。1942年，這種技術(shù)投入實(shí)際應(yīng)用，而澤尼克本人也于1953年獲得諾貝爾物理獎(jiǎng)[4]。
圖1：利用相差技術(shù)和明場照明拍攝到的犬腎細(xì)胞（MDCK）圖像。
圖2：利用相差技術(shù)和明場照明拍攝到的單細(xì)胞生物變形蟲變形桿菌圖像
光波干涉
光路長度（OPL）是介質(zhì)的折射率（n）與光線在介質(zhì)中兩點(diǎn)之間傳播距離（d）的乘積。OPL = nd。光路可能需要光線穿過多種介質(zhì)，例如氣體、液體或固體。常見示例包括光線從空氣進(jìn)入水中，或者從空氣進(jìn)入玻璃。光路長度與光線的傳輸時(shí)間和速度有關(guān)。光路長度的差異導(dǎo)致光波穿過樣本的速度不同，即相移。因此，相位存在差異。與周圍介質(zhì)相比，較高的折射率會導(dǎo)致光波減速并降低相位。
干涉描述了兩道光波之間的相互作用，并按照疊加原則形成新的波形。光波干涉的相關(guān)參數(shù)是它們的振幅。如果兩道波相互干涉，生成光波的振幅等于每個(gè)干涉光波振幅的矢量和。
如果形成光波的振幅增大，這種干涉可以描述為相長干涉（構(gòu)造性）。只要兩者的波峰和波谷在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)相遇，就會出現(xiàn)這種情況。也有可能，一道光波的波峰與另一道的波谷在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)相遇。這種情況會導(dǎo)致形成振幅較低的光波。這兩道光波之間的干涉稱為相消干涉（破壞性）。
相差顯微鏡中的光路
相關(guān)顯微鏡的關(guān)鍵元件是環(huán)形光圈和相位板。環(huán)形光圈位于聚光鏡的前焦平面內(nèi)，限制了光波穿透的角度。相位板位于物鏡的后焦平面內(nèi)，搭配相差環(huán)，其材料可以按照λ/4的幅度調(diào)暗穿過相位板的光線，其中λ代表光線的波長。
在采用科勒照明的相差顯微鏡[5]中，不與樣本相互作用的光波在物鏡的后焦平面上聚焦為明亮的光環(huán)。光環(huán)沿光軸方向上與相差環(huán)形成空間匹配，引發(fā)未偏離光的相移。樣本衍射產(chǎn)生的光線并不完全照射在相差環(huán)上，因此不受影響。
受影響和未受影響的光波之間，最高可以形成λ/2的總相移。未偏斜光的相位在相差環(huán)處會提前λ/4，穿過生物樣本時(shí)的衍射或散射光波通常會延后λ/4。λ/2的總相移會令光波在圖像平面內(nèi)產(chǎn)生相消干涉。為了增強(qiáng)對比度，未偏斜光在穿過相差環(huán)時(shí)會變暗并且有一部分光線會被相差環(huán)吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情況，因?yàn)槟菚档蛯Ρ榷取?/p>
相差顯微鏡中觀察到的λ/2相移會產(chǎn)生最大程度的相消干涉效應(yīng)，因?yàn)楣獠ǖ牟ǚ搴筒ü仍谕粫r(shí)間點(diǎn)重合。因此，生成光波的振幅會減少，相位物體的相移轉(zhuǎn)換為振幅偏移。
圖3：相差顯微鏡中的光路穿過聚光鏡環(huán)的環(huán)形光線通過聚光鏡聚焦在樣本上。部分環(huán)形光線被樣本的光學(xué)致密結(jié)構(gòu)（例如細(xì)胞膜、細(xì)胞器等）衍射，出現(xiàn)大約?λ（通常適用于生物樣本）的相移。這種相移和衍射光會繞過相差環(huán)，因此幾乎不受相差環(huán)（通常位于物鏡的后焦平面內(nèi)）的影響。相反，來自聚光鏡環(huán)的直射環(huán)形光線會直接到達(dá)相差環(huán)，后者會調(diào)暗直射光并引起相移（通常提前?λ或延遲?λ，以獲得正相差）。由于樣本折射光線與穿過相差環(huán)的光線之間存在高達(dá)?λ的總相移，因此會產(chǎn)生相消干涉。所以，光學(xué)致密結(jié)構(gòu)會顯得更暗（正相差）
圖4：相差環(huán)是相差顯微鏡的核心部件。通常它由灰色濾光片和保留板組成。穿過樣本且未發(fā)生衍射的光線部分穿過相差環(huán)（左箭頭）灰色濾光片會讓光線變暗以避免輻射。保留板會延遲非衍射光的相位，以便與穿過樣本時(shí)發(fā)生衍射并經(jīng)歷相移的光波形成干涉（右箭頭）
正相差和負(fù)相差——兩種形式的相差
相差分為兩種形式：正相差和負(fù)相差兩者的主要區(qū)別在于使用的相位板。對于正相差，穿過相差環(huán)的光線相比偏斜光會增加，對于負(fù)相差，相位會減少。負(fù)相差中的相位延遲會產(chǎn)生相位差異，導(dǎo)致光波受到破壞。光波存在相位，并引發(fā)相長干涉，而非相消干涉，導(dǎo)致生成的光波振幅增加。
在正相差顯微鏡中，折射率高于周圍介質(zhì)的對象比折射率較低的對象顯得更暗。在負(fù)相差顯微鏡中，情況完全相反。
解讀相差圖像
相差顯微鏡可以視覺呈現(xiàn)光線穿過樣本時(shí)的光路長度差異。光路長度與樣本的厚度和折射率有關(guān)。細(xì)胞膜和細(xì)胞器等細(xì)胞結(jié)構(gòu)對于光路長度具有深遠(yuǎn)的影響。由于許多細(xì)胞（特別是細(xì)胞培養(yǎng)液中）具有扁平且規(guī)則的形狀，因此使用明場顯微鏡幾乎無法看到它們。
這種細(xì)胞相差圖像可以放大細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異，可以視為光致密圖，因?yàn)?strong>光密度對于樣本或樣品的折射率有很大影響。不過，多種效應(yīng)會導(dǎo)致相差圖像的正確解釋變得復(fù)雜，因?yàn)樗鼈儾恢苯尤Q于光路長度的差異。
光暈效應(yīng)可以描述大型相位物體周邊出現(xiàn)的正相差亮邊或負(fù)相差暗邊。光暈會形成是因?yàn)閬碜詷颖镜牟糠盅苌涔鈺┻^相差環(huán)。未偏振波形成的光環(huán)要比相差環(huán)小一點(diǎn)，因此來自樣本的低空衍射光波可以穿過相差環(huán)。穿過相差環(huán)的偏斜光保持著90°的相差，因此不受干涉的影響。這會導(dǎo)致對比度反轉(zhuǎn)，導(dǎo)致大型物體的邊緣出現(xiàn)光暈。
遮光效應(yīng)是指樣本的均勻部分和周圍介質(zhì)一樣，以相同的光強(qiáng)度來顯示所發(fā)生的情況雖然穿過這些區(qū)域的光線會發(fā)生相移，但只有輕微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，這些光波進(jìn)入相差環(huán)時(shí)，就像未偏斜光一樣，不會發(fā)生干涉。
相差顯微鏡的另一個(gè)問題就是可能發(fā)生對比度反轉(zhuǎn)。如果折射率很高的物體旁邊是折射率較低的物體，它們就會顯得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在這些區(qū)域，相移不是生物樣本常見的λ/4，因此會出現(xiàn)相長干涉，而不是相消干涉（這與負(fù)相差正好相反）。
雖然這些效應(yīng)會讓相差圖像在解讀時(shí)更加困難，但相差顯微鏡是一種簡單且重要的光學(xué)對比成像技術(shù)，可以對相位物體成像。此外，相差顯微鏡能夠研究活體樣本中的細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)，因此是生物學(xué)研究中最為常用的光學(xué)對比法。
圖5：曲霉菌的相差圖像
圖6：大鼠睪丸的相差圖像
參考文獻(xiàn)：（上下滑動查看更多）
